發(fā)酵后的E.Coli培養(yǎng)液 |
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用低速大容量冷凍離心機(jī)，大容量甩平或角式轉(zhuǎn)頭（3000~6000rpm,30~15min）或高速連續(xù)流轉(zhuǎn)頭（10000～18000rpm，流量300～600ml/min） |
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E.Coli菌體沉淀 |
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用溶菌酶破細(xì)胞壁 |
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用表面活性劑破細(xì)胞膜（如Triton X-100，SDS等） |
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大部分染色體DNA粘附在膜蛋白上，用一定濃度的鹽溶液（如1 mol NaCl 或1 mol 醋酸鈉）溶解后臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf管10000rpm，10min）或高速冷凍離心機(jī)10000～12000rpm×10min，上清中大部分為染色體DNA，沉淀中含質(zhì)粒DNA，降解的質(zhì)粒DNA，RNA及蛋白質(zhì) |
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在沉淀中加入異丙醇得到粗制的質(zhì)粒DNA |
| 沉淀中加入TE緩沖液（pH8.0） |
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粗制DNA在-20℃在重力狀態(tài)喜愛(ài)沉淀15min以上，高速離心機(jī)12000rpm（近15000g）4℃離心5min去上清 |
| 用苯酚抽提去蛋白質(zhì)或用分子篩去蛋白質(zhì)
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| 用RNA酶降解RNA |
真空中抽去異丙醇，溶液中加入TE緩沖液 |
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| 過(guò)柱（聚丙烯酰胺）RNA留柱，質(zhì)粒DNA過(guò)柱 |
加入E.B及Triton X-100,在CsCl中（預(yù)制梯度或平衡等密度離心，自形成梯度）用角轉(zhuǎn)頭，近垂直轉(zhuǎn)頭做超速離心（見(jiàn)文獻(xiàn)10） |
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| 較純的質(zhì)粒DNA，但含有5～10%的染色體DNA和降解的DNA片段 |
剩余的蛋白質(zhì)上浮，RNA沉淀，染色體DNA在離心管中上部形成區(qū)帶，質(zhì)粒DNA在離心管中下部形成純樣品區(qū)帶 |
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密度梯度儀或其他簡(jiǎn)易方法從離心管中抽出，經(jīng)過(guò)帶流動(dòng)池的分光光度計(jì)后分部收集，從吸光度峰可以判斷質(zhì)粒DNA所在的位置 |
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去CsCl，去其他組分得到高純度質(zhì)粒DNA | ||
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